對(duì)于無參物種或參考基因組不完善的物種，想要開展基因調(diào)控機(jī)制研究，往往在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，將得到的數(shù)據(jù)與近緣種的參考基因組比對(duì)，或借助Trinity拼接成Unigenes后與NR、Swissprout、KEGG等公共數(shù)據(jù)庫完成基因定性。然而，在物種的演化進(jìn)程中，即便屬于同屬物種，其基因組也存在一定的差異性。尤其在“種”的選育培育過程，其基因組組成已朝著人類選擇的方向改變。因此，對(duì)優(yōu)良“種”的基因組測(cè)序，不僅可了解其與其他品種的基因組成上的差異，還為優(yōu)良種的特異優(yōu)勢(shì)表型提供分子基礎(chǔ)。輔以代謝組，了解表型差異的分子特征，同時(shí)借助轉(zhuǎn)錄組將基因在轉(zhuǎn)錄層面的差異表達(dá)與代謝（表型）層面的分子響應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，可直接篩選出調(diào)控優(yōu)勢(shì)性狀的重要基因及其調(diào)控機(jī)制。

今天跟大家分享一篇發(fā)表在《 Frontiers in Plant Science 》上，研究腺枝葡萄GH6酚類化合物合成和積累的文章。文章中作者借助基因組測(cè)序獲得完整的GH6葉片基因組信息并利用廣泛靶向代謝組篩選在GH6中豐度更高的酚類相關(guān)化合物。最后開展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，篩選調(diào)控酚類物質(zhì)在不同葡萄品種中差異積累的關(guān)鍵基因。實(shí)現(xiàn) 功能基因→基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控→代謝產(chǎn)物的貫穿性研究，同時(shí)完善的基因組信息也為GH6其它優(yōu)良品質(zhì)研究及今后的遺傳改良提供了重要依據(jù)。

發(fā)表時(shí)間：2023年1月

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science

IF：6.627

合作單位：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所

發(fā)表時(shí)間：2023年1月

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science

IF：6.627

合作單位：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所

研究背景與目的

野生葡萄中的腺枝葡萄（ Vitis adenoclada ）因其對(duì)高溫、潮濕、真菌病蟲害、干旱、土壤貧瘠具備較高的耐受性，已成為廣西當(dāng)?shù)刂匾尼劸圃牧稀７宇悾≒henolics）物質(zhì)是影響葡萄感官品質(zhì)的重要化合物，進(jìn)而會(huì)影響葡萄酒的口感。研究表明，酚類物質(zhì)的合成和濃度受基因調(diào)控等影響。了解葡萄的基因組信息為揭示其品質(zhì)研究具有重要意義。 本研究主要目的，即借助基因組揭示野生腺枝葡萄GH6（ Vitis adenoclada ）的基因組信息，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、代謝組，探索野生葡萄中調(diào)控酚類合成和濃度的關(guān)鍵基因， 助力葡萄的品質(zhì)研究。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）取材：

選擇赤霞珠（ V. vinifera , CS）、馬瑟蘭（ V. vinifera , Mar）、味而多（ V. vinifera , PV）、凌豐NW196（V. heyneana × V. vinifera）、Yeniang No.2,（ V. adenoclada , YN2）桂黑珍珠4號(hào)（ V. adenoclada , GH4）、桂黑珍珠5號(hào)（ V. adenoclada , GH5）、桂黑珍珠6號(hào)（ V. adenoclada , GH6）共8個(gè)葡萄品種為本次研究材料。

展開全文

（2）組學(xué)研究：

理化指標(biāo)分析：分別測(cè)量8種葡萄漿果的鮮重、pH值、總可溶性固形物（TSS）、可滴定酸度（TA），每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；

基因組：收集新鮮的GH6嫩葉進(jìn)行基因組研究；

轉(zhuǎn)錄組：分別收集8種漿果進(jìn)行RNA-seq，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

代謝組：樣本類型同轉(zhuǎn)錄組。

研究思路

研究結(jié)果

1. 基因組檢測(cè)結(jié)果的整體描述

基于Illumina測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行K-mer分析，發(fā)現(xiàn)GH6基因組大小約為524.23Mb，含有0.62%的雜合度和49.18%的重復(fù)序列。ONT測(cè)序總共生成了103.24 Gb的原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控后共獲得94.99 Gb的clean reads。對(duì)clean reads進(jìn)行Nanopore組裝和校準(zhǔn)，獲得GH6的基因組草圖大小約為498.21Mb，conting N50長2.91Mb。

為進(jìn)一步獲取GH6基因組中的染色體信息，通過Hi-C輔助組裝技術(shù)將481.44Mb序列組裝掛載到19條假染色體上，N50為25.26Mb（圖1）。CEGMA和BUSCO分析表明基因組組裝質(zhì)量和完整性較高（表1）。結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫、GO、KEGG、KOG、TrEMBL、NR數(shù)據(jù)庫對(duì)基因組進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)498.27Mb基因組包含221.78Mb轉(zhuǎn)座元件，28660個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。

圖1 腺枝葡萄GH6品種基因組草圖

表1 CEGMA和BUSCO分析GH6基因組組裝質(zhì)量和完整度

對(duì)GH6（ V. adenoclada ）、PN40024（ V. vinifera ）、光榮（ V. riparia ）、Trayshed（ V. rotundifolia ）、紅棗（ Ziziphus jujuba ）、蘋果（ Malus domestica ）、獼猴桃（ Oryza sativa ）、無油樟（ Amborella trichopoda ）、擬南芥（ Arabidopsis thaliana ）共10個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)整合分析。 韋恩圖結(jié)果表明，與PN40024、光榮、Trayshed葡萄品種相比，有475個(gè)基因在GH6中特異性表達(dá)（圖2B）。利用從10個(gè)物種中共鑒定出的417個(gè)保守單拷貝直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)腺枝葡萄（ V. adenoclada ）與葡萄（ V. vinifera ）距離更緊密，兩者與光榮（ V. riparia ），Trayshed（ V. rotundifolia ）處同一分支上。同時(shí)，在GH6（ V. adenoclada ）的形成過程中擴(kuò)展了223個(gè)基因家族，主要與植物的防御過程有關(guān)，暗示GH6基因家族的擴(kuò)增可助力其抵抗疾?。▓D2C）。 基因組共線性分析表明，GH6與PN40024、光榮、Trayshed間具有高度的基因秩序性和位點(diǎn)保守性且GH6中第7號(hào)染色體與光榮第7號(hào)染色體，第二十號(hào)染色體存在線性相關(guān)（圖2D）。

圖2 GH6基因組與其它代表性植物的比較基因組學(xué)分析

*A：10個(gè)物種的基因組基因種類及數(shù)量分析；B：四個(gè)葡萄變種的基因家族韋恩圖；C：10個(gè)物種系統(tǒng)發(fā)育樹；D：四個(gè)葡萄變種的基因組共線性示意圖

2. 腺枝葡萄GH6代謝物特征與其他品種存在差異，其主要富含酚類、黃酮醇類、水楊酸類等物質(zhì)

上文提到，酚類物質(zhì)是影響腺枝葡萄GH6品質(zhì)的重要候選代謝物，是本研究重點(diǎn)關(guān)注的代謝物之一。為比較酚類種類和濃度在不同品種間的差異，作者借助廣泛靶向代謝組對(duì)8個(gè)品種的葡萄進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，代謝組檢測(cè)獲得674種代謝物，并根據(jù)豐度差異可將代謝物劃分為兩大類型（圖3A）。主成分分析和聚類樹結(jié)果表明，GH6和YN2具有相似的代謝物特征，8個(gè)品種的葡萄漿果的代謝特征存在一定差異（圖3B，C）。

圖3 8個(gè)品種的葡萄漿果的代謝物特征

*A：代謝物聚類熱圖，展示代謝物在不同樣本中的豐度差異；B：樣本PCA分析，展示樣本代謝物特征的相似性；C：樣本聚類樹，描述樣本與樣本間的距離，也可表明樣本的相似性

K-means聚類將674種代謝物劃分成12個(gè)亞類，其中第8和第10亞類中有42種代謝物在腺枝葡萄中的豐度更高，其主要為類黃酮、酚類物質(zhì)（圖4A）。相比于其他品種，GH6更富含酚酸類（phenolic acids）、水楊酸類（salicylic acid）、白藜蘆醇（resveratrol）、白藜蘆醇苷（piceid）、槲皮素（quercetins）、楊梅素（myricetins）、山萘酚（kaempferols）等物質(zhì)。

圖4 8個(gè)葡萄品種漿果代謝物特征分析

*A：餅圖，描述第8亞類，第10亞類中42種代謝物組成占比；B：餅圖，描述第8亞類，第10亞類中31種代謝物組成占比；C：熱圖，分析8種葡萄漿果中代謝物含量差異；

3. 調(diào)控酚類物質(zhì)合成和濃度的轉(zhuǎn)錄過程

酚類化合物差異積累是否與上游基因調(diào)控有關(guān)？隨即作者借助RNA-seq，將獲得的數(shù)據(jù)與自測(cè)基因組比對(duì)并使用DESeq2進(jìn)行差異分析，按照|log 2 FC|≥1，F(xiàn)DR＜0.05為閾值篩選出13,423個(gè)差異表達(dá)基因。對(duì)參與苯丙醇/類黃酮生物合成途徑相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)編碼苯丙烷代謝途徑上游酶的基因，如： PAL (EC:4.3.1.24)、 C4H (EC:1.14.13.11)、 STS (EC 2.3.1.74)在PV、NW96、YN2、GH6品種中的豐度更高。 COMT (EC 2.3.1.74)、 FLS 、 LAR (EC 5.5.1.6)、 ANR (EC:1.3.1.77)、 UFGT (EC 2.4.1.11.5)在腺枝葡萄的四個(gè)變種中豐度更高（圖5）。

圖5 酚類合成相關(guān)差異表達(dá)基因-酚類化合物通路示意圖

*注：紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)。

研究表明轉(zhuǎn)錄因子（TF）對(duì)基因的表達(dá)和酚類物質(zhì)的合成也具備調(diào)控作用。作者借助植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫注釋到1442個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，通過計(jì)算轉(zhuǎn)錄因子與基因豐度的Pearson相關(guān)系數(shù)，共篩選到PALs，COMT，STSs，CHSs，UFGT 5種與TF關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的酚類合成相關(guān)基因，這些基因主要與MYB、ERF、bHLH、GRAS、NAC、WRKY、C2H2Z轉(zhuǎn)錄因子家族顯著正相關(guān)，具有較高的共表達(dá)（圖6），暗示這些TFs是調(diào)控酚類代謝物相關(guān)基因上調(diào)的重要原因。

圖6 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)酚類化合物合成相關(guān)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

*注：綠色為轉(zhuǎn)錄因子（轉(zhuǎn)錄酶），藍(lán)色為酚類合成相關(guān)基因

圖7 差異基因WGCNA分析

*A：差異基因相關(guān)性聚類分析；B：模塊—酚類化合物相關(guān)性分析；C：關(guān)鍵模塊內(nèi)基因GO富集分析

為直接揭示葡萄品質(zhì)形成過程中基因與代謝物的關(guān)聯(lián)，使用比較組中的所有差異表達(dá)并過濾掉其中在50%以上的樣本中FPKM＜0.8的基因進(jìn)行WGCNA分析，共獲得9個(gè)模塊（圖7A）。計(jì)算模塊特征值與酚類化合物豐度的相關(guān)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)lavenderblush模塊內(nèi)的基因與咖啡酸、阿魏酸、水楊酸、顯著正相關(guān)。navajowhite，tan模塊與黃烷-3-醇和部分花青素顯著正相關(guān)。cyan模塊主要與二苯乙烯和楊梅素顯著正相關(guān)。其中調(diào)空酚類合成的相關(guān)基因STS主要在darkslateblue模塊中（圖7B）。

對(duì)模塊內(nèi)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子注釋，發(fā)現(xiàn)lavenderblush模塊中有93種TFs，其中有8類TFs（ERF5、ARF19、MYB2、BLH9、WRKY28、GLK1、MYB73-1、MYB73-2）與COMT（酚類合成相關(guān)基因）顯著正相關(guān)，暗示這些TFs可涉及阿魏酸的合成。在cyan模塊內(nèi)共注釋到315個(gè)TFs，其中有6類TFs（ARF2A、BLH7、HOX16、LRP1、MYB12、UFGT）與FLS顯著相關(guān)，有6類TFs（ZFP2、WRKY44、MYB12、ARF2A、HOX22、LRP1）與UFGT顯著相關(guān)，說明這些TFs可涉及黃酮醇和花青素的合成。

文章小結(jié)

通覽全文不難發(fā)現(xiàn)文章的架構(gòu)組成、分析思路、數(shù)據(jù)挖掘相互獨(dú)立但又層層關(guān)聯(lián)。

文章開篇介紹腺枝葡萄GH6葉片的基因組測(cè)序結(jié)果，利用ONT測(cè)序、Nanopore矯正并借助Hi-C輔助組裝共獲得498.27Mb的基因組信息并將481.44Mb序列掛載到19條染色體中。通過基因組功能注釋、基因組共線性分析、系統(tǒng)發(fā)育樹等各項(xiàng)分析策略，發(fā)現(xiàn)腺枝葡萄在進(jìn)化過程中，本文重點(diǎn)關(guān)注的GH6在形成過程中確實(shí)與其它葡萄品種的基因組信息存在一定差別。GH6基因組草圖的繪制為接下來的GH6漿果品質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)；

本文除描繪GH6的基因組草圖外，同時(shí)關(guān)注影響GH6漿果品質(zhì)的酚類化合物組成特征。在第二部分引入了廣泛靶向代謝組，篩選出在GH6中豐度更高的一些酚類化合物。

文章最后，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將基因組信息與代謝組信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)，直接探索基因轉(zhuǎn)錄水平的差異對(duì)下游代謝物（酚類化合物）合成和積累的調(diào)控機(jī)制。文章一氣呵成，同時(shí)完成了三個(gè)主要任務(wù)（腺枝葡萄GH6基因組測(cè)序、GH6代謝物特征、基因轉(zhuǎn)錄對(duì)代謝物合成的調(diào)控方式），為葡萄其它品質(zhì)的遺傳改良研究提供參考價(jià)值。

最后，基迪奧可提供上文提到的基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組檢測(cè)服務(wù)，配以組學(xué)數(shù)據(jù)分析團(tuán)隊(duì)、多組學(xué)項(xiàng)目技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘培訓(xùn)班，讓您不僅可享受專業(yè)團(tuán)隊(duì)數(shù)據(jù)分析，還可獨(dú)立掌握數(shù)據(jù)挖掘技能，真正實(shí)現(xiàn)生物學(xué)意義研究全面、自主、可控。

參考文獻(xiàn)

*未經(jīng)許可，不得以任何方式復(fù)制或抄襲本篇文章之部分或全部內(nèi)容。版權(quán)所有，侵權(quán)必究。

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